Cultrex 3D Spheroid Cell Proliferation / Viability Assay

Descrizione

Cultrex 3-D Spheroid Cell Proliferation / Viability Assays: 

Il saggio di proliferazione e vitalità di cellule tumorali in coltura 3D. Metodo flurimetrico o colorimetrico.
  • Utilizzo della coltura 3D per mimare le condizioni fisiologiche
  • Possibilità di trattare le cellule in coltura con agenti chimici, farmaci, ormoni che modificano la risposta cellulare 
  • Acquisizione e analisi di immagini per una valutazione quantitativa
  • Valutazione della vitalità/sopravvivenza delle cellule all’interno degli sferoidi in seguito a trattamenti farmacologici, saggio colorimetrico con MTT test, saggio fluorimetrico con Resazurina.
Catalogo Descrizione Quantità
3510-096-K Cultrex® 3-D Spheroid Fluorometric Proliferation/Viability Assay 96 campioni
3511-096-K Cultrex® 3-D Spheroid Colorimetric Proliferation/Viability Assay 96 campioni

Il 3-D Spheroid Fluorometric Proliferation/Viability Assay costituisce uno strumento utile per mimare la risposta del tumore in vitro. Il kit utilizza una piastra 3-D Culture Qualified 96 Well Spheroid Formation abbinata a una speciale Spheroid Formation ECM per permettere l’aggregazione e/o la formazione degli sferoidi di cellule. Il reagente non fluorescente Resazurina è ridotto a Resorufina fluorescente (eccitazione a 530-560 nm/emissione a 590 nm) all’interno dei mitocondri.

Il kit 3-D Spheroid Colorimetric Proliferation/Viability Assay è fornito di reagente colorimetrico per la misurazione della vitalità cellulare MTT per l’analisi quantitativa all’end point. L’anello di tetrazolio dell’MTT è scisso dalle deidrogenasi mitocondriali accumulando sali di formazano di colore viola che sono successivamente solubilizzati per la quantificazione usando il Detergent Reagent[11]. Il 3-D Spheroid Colorimetric Proliferation/Viability Assay fornisce quindi uno strumento utile per il modeling di tumori solidi e del loro comportamento in vitro.

Altri prodotti per colture 3D:

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Spheroid Cell Proliferation / Viability Assay.

A sinistra (blu) – test di proliferazione. A destra (rosso) – test di vitalità.

Attualmente, il metodo più diffuso per lo screening di composti e per l’analisi di pathway di segnalazione prevede la coltura di cellule tumorali su superficie rigida di plastica trattata, dove le cellule aderiscono in modo aspecifico e proliferano come monostrato, e in seguito a questo, queste cellule perdono la loro morfologia e i profili di espressione genica associati al tumore in vivo. Una alternativa è l’utilizzo di sospensioni di singole cellule intrappolate in un idrogele che funge da matrice extracellulare (ECM) per costituire colture 3-D; tuttavia le strutture risultanti sono disperse in tutto il gel e mostrano molta variabilità sia di morfologia che di dimensioni, limitando perciò la determinazione di gradienti fisiologici e influenzando negativamente la riproducibilità di ogni saggio.

Per risolvere questi problemi di riproducibilità e per costruire sistemi tumorali più simili alle condizioni fisiologiche, sono stati integrati nei modelli di coltura 3-D alcuni metodi di formazione di sferoidi pluricellulari. 

I ricercatori hanno utilizzato le colture di sferoidi per la ricerca sul cancro per più di 40 anni[1-3]; tuttavia molte erano le limitazioni riguardanti quali linee cellulari erano capaci di formare sferoidi in modo spontaneo. Per la formazione spontanea degli sferoidi, è stato dimostrato che le cellule producono una matrice ECM depositata sulla superficie esterna dello sferoide e che le linee cellulari che non possono formare spontaneamente gli sferoidi erano mancanti di questa ECM [4, 5]. È stato dimostrato in seguito che l’aggiunta di proteine della ECM a linee cellulari incapaci di formare sferoidi induceva spontaneamente la formazione di sferoidi in colture 3-D, rendendo quindi la forma compatibile con la maggior parte dei modelli di tumore solido [6].

Noi abbiamo ottimizzato questo processo, inserendo i reagenti necessari per valutare le diverse linee cellulari usando questo metodo:

Basta semplicemente raccogliere le cellule, risospenderle in EMC per la formazione degli sferoidi e poi coltivare il tutto in una piastra di coltura a 96 pozzetti specificamente pensata per la formazione degli sferoidi. Questi generalmente sono visibili in 48 – 72 ore.

Il numero di cellule e I tempi di coltura determinano la dimensione degli sferoidi, dato che ogni pozzetto produce uno sferoide, i ricercatori hanno controllo completo sulla dimensione degli sferoidi limitando fortemente la variabilità tra i pozzetti. Per la maggior parte dei modelli tumorali, sono raccomandati sferoidi di dimensioni di 400 – 500 µm di diametro. Questo è sufficiente a stabilire un gradiente fisiologico di nutrienti, ossigeno, pH e cataboliti dovuto alla limitazione di diffusione tra gli strati delle cellule. Un altro effetto di questi gradienti è la formazione di popolazioni eterogenee con cellule necrotiche al centro, cellule quiescenti negli strati più profondi e cellule proliferanti negli strati più esterni e sulla superficie; tutti questi fattori rendono una riproduzione fedele di un tumore devascolarizzato [7-10].

Una volta formato, questo aggregato di cellule tumorali può essere trattato con composti farmacologicamente attivi per valutare l’effetto sulla crescita dello sferoide; in alternativa, è possibile manipolare specifici geni o vie di segnalazione per valutare l’effetto sull’espansione del tumore in vitro.

Questo processo può essere monitorato in tempo reale e in assenza di marcatori utilizzando solamente un analizzatore di immagini per misurare l’area dello sferoide, inoltre il kit è fornito di un reagente per misurare la vitalità cellulare, la Resazurina, per analisi quantitativa all’end point. Il reagente non fluorescente Resazurina è ridotto a Resorufina fluorescente (eccitazione a 530-560 nm/emissione a 590 nm) all’interno dei mitocondri [11].

 

Componenti del kit acquistabili anche separatamente:

Pubblicazioni correlate:

  1. Inch, W.R., J.A. McCredie, and R.M. Sutherland, Growth of nodular carcinomas in rodents compared with multi-cell spheroids in tissue IFU0266 Rev 0 Status: RELEASED printed 5/8/2013 by nhemendinger 15 E4/17/13v0 culture. Growth, 1970. 34(3): p. 271-82.
  2. Folkman, J. and M. Hochberg, SELF-REGULATION OF GROWTH IN THREE DIMENSIONS. The Journal of Experimental Medicine, 1973. 138(4): p. 745-753.
  3. Sutherland, R.M., et al., A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med, 1970. 18(5): p. 491-5.
  4. Kawata, M., et al., Neural Rosette Formation within in Vitro Spheroids of a Clonal Human Teratocarcinoma Cell Line, PA-1/NR: Role of Extracellular Matrix Components in the Morphogenesis. Cancer Research, 1991. 51(10): p. 2655-2669.
  5. Kelm, J.M., et al., Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering, 2003. 83(2): p. 173-180.
  6. Ivascu, A. and M. Kubbies, Rapid Generation of Single-Tumor Spheroids for High-Throughput Cell Function and Toxicity Analysis. Journal of Biomolecular Screening, 2006. 11(8): p. 922-932.
  7. Vinci, M.M., Advances in establishment and analysis of 3D tumour spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology, 2012. 10(1): p. 29.
  8. Kunz-Schughart, L.A., et al., The Use of 3-D Cultures for HighThroughput Screening: The Multicellular Spheroid Model. Journal of Biomolecular Screening, 2004. 9(4): p. 273-285.
  9. Sutherland, R.M., et al., Oxygenation and Differentiation in Multicellular Spheroids of Human Colon Carcinoma. Cancer Research, 1986. 46(10): p. 5320-5329.
  10. Hirschhaeuser, F., et al., Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology, 2010. 148(1): p. 3-15.
  11. Nociari, M.M., et al., A novel one-step, highly sensitive fluorometric assay to evaluate cell-mediated cytotoxicity. Journal of Immunological Methods, 1998. 213(2): p. 157-167.

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